近年來隨著基因編輯技術的發展及在農作物育種領域的應用，相對于傳統育種周期的8-10年，基因編輯育種可將育種周期縮短至3年左右，并可快速精準創制新的種質資源，有效提高作物產量、抗病蟲害特性及品質性狀等。比如基因編輯的水稻品種畝產提高15%以上、油酸含量達到80%以上的基因編輯大豆、產量提高10%以上的基因編輯玉米、抗除草劑小麥、強化甜度的草莓、強化風味的蔬菜等。全球范圍內，基因編輯已經在水稻、玉米、大豆、小麥和番茄等農作物以及豬、牛、羊等農業動物中廣泛應用，糯玉米、高油酸大豆、抗褐變馬鈴薯、高GABA番茄、抵抗褐變的蘑菇等基因編輯產品陸續在美國、日本等國家上市推廣。
基因編輯技術用于農業動植物育種可以說是我們打贏種業翻身仗，開展種源 “卡脖子” 技術攻關的一把利劍，但由于之前對基因編輯是否屬于轉基因存在爭議，且轉基因品種監管方面一直面臨著諸多挑戰，我國正式的監管制度和法規一直未能出臺，限制了基因編輯育種商業化。對基因編輯生物的監管基本沿用《農業轉基因生物安全管理條例》框架。其實基因編輯的主要目的是改變作物原有的部分基因，達到基因敲除或對蛋白表達水平進行微調，?不是導?外源基因，簡單來說就是重組，而?添加。CRISPR基因編輯技術更是在2020年獲得了諾貝爾化學獎。中國科學院院士李家洋表示“基因（組）編輯是國際育種界正在競爭的制高點。如果雜交育種是1.0版本，分子標記育種是2.0，轉基因育種是3.0，那么基因（組）編輯育種就是4.0版本。”
好消息是隨著今年我國新的《種子法》頒布及世界種業市場簡化基因編輯作物監管的大方向，2022年1月24日，中國農業農村部制定公布了《農業用基因編輯植物安全評價指南（試行）》，對我國基因編輯生物育種技術研發與產業推動具有里程碑意義。今年6月8日，農業農村部官網發布重磅通知《國家級轉基因大豆品種審定標準（試行）》，《國家級轉基因玉米品種審定標準（試行）》已經印發，這都預示著基因編輯育種及轉基因大豆玉米商業化在即！
農業用基因編輯植物安全評價指南里全面涵蓋了申報程序、靶基因相關情況、基因編輯方法、靶基因編輯情況、載體序列殘留情況、脫靶情況、安全證書申請所需要的資料等方面。相信這份安全評價指南，將大大加快基因編輯育種商業化進程！
而轉基因大豆玉米品種審定標準涵蓋了轉化體真實性， 轉基因目標真實性（抗除草劑，抗蟲）及回交轉育的轉基因品種三個方面。其中關于回交轉育的轉基因品種的審定標準為：
轉基因品種的受體品種已通過審定，基本性狀與受體品種無顯著性差異，試驗平均產量較受體品種增產≥0.0%；采用 SSR 分子標記方法檢測，除轉化體導入所致位點差異外，轉基因品種與受體品種 DNA 指紋檢測差異位點數＜2個。
時至今日基因編輯技術的發展和應用可以說是日新月異，勢頭正猛?；蚓庉嬓始斑z傳轉化率都在不斷提高，脫靶率在持續降低，我國科學家也發現了新的工具酶Cas12i、Cas12j、Cas12a等，解決了國外Cas9的專利限制問題，在農業用植物育種及基因治療領域都有非常廣闊的應用前景。
那么CRISPR基因編輯技術的原理是什么？如何開展基因編輯工作？一個流程需要多長時間？過程中都要用到哪些工具？作為生命科學工具制造商的LGC Biosearch technologies又可以提供哪些產品和解決方案呢？
CRISPR/Cas9技術是繼鋅指核酸酶(zinc-fingernuclease, ZFN)、轉錄激活樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)等技術后最為重要的基因改造技術，可以在基因敲入、基因敲除、基因激活、基因沉默、表觀遺傳修飾及3D基因結構改變中進行廣泛的應用。我們可以發現第1-4步首先要設計需要編輯的基因位點，也就是我們說的靶基因。簡單來說CRISPR基因編輯技術是一把科學精準的剪刀，但要用在哪里，還要我們精準解碼基因信息，挖掘、定位控制優良性狀的可以進行基因編輯的靶基因，這是基因編輯的第一步，也是最重要的基礎。有道是 “萬事開頭難”，當前，科研人員大量工作仍在基因挖掘階段，這也是基因編輯工作最大的難點之一。
LGC Biosearch Technologies 專有的KASP?基因分型技術通過SNP及Indel分子標記進行基因初定位及精細定位，助力關鍵主效功能靶基因定位及克隆，并幫助全基因組關聯分析后的候選基因功能驗證，使我們的育種家不斷豐富可用于基因編輯的靶基因庫，解決基因編輯的“開頭難”問題。目前相關發表文獻有千余篇，涉及到水稻、玉米、小麥等主糧作物，及番茄、黃瓜、大白菜等蔬菜作物，還有花生、油菜、大豆等經濟作物的抗病蟲害、產量及品質相關基因，應用前景廣泛。
第5步為基因編輯及載體構建，這個過程通常需要4天左右。 其主要利用CRISPR RNA（crRNA）與轉錄激活 crRNA（Trans-activating crRNA, tracrRNA）退?形成的復合物特異識別基因組序列，引導 Cas9 核酸內切酶在?的?段?成 DNA 雙鏈斷裂，這個識別復合體可以通過融合crRNA 與 tracrRNA 序列形成 sgRNA（single-guided RNA）進?簡化。除了體外轉錄sgRNA 外，現在我們也可以通過化學合成的方法合成sgRNA，并在合成過程中添加化學修飾，以減少核酸酶降解，提高整體編輯性能，提高其轉化效率。該方法具有高效便捷、脫靶效應低、編輯效率高、無細胞毒性等優勢，逐漸成為基因編輯基礎科研實驗的絕佳選擇。LGC Biosearch Technologies雖然沒有相關的工具酶產品，但可以提供高性價比的各種型號的Mermade 核酸合成儀，可化學合成gRNA、sgRNA等CRISPR基因編輯技術中的關鍵組分，并可進行硫代和甲氧基等修飾，提高sgRNA的穩定性，降低脫靶效應。
第6-126步（此過程也需要4天左右的時間），斷開的DNA雙鏈在同源重組（HR）作?下，供體質粒上的?標基因及篩選標記（或其他遺傳元件）在斷裂處被整合進基因組，完成DNA單堿基或片段編輯更改（此步為可選項，也可以不添加目標基因，只將目標片段敲除，創制突變體）。然后進行轉化/轉染并進行基因編輯個體基因型檢測從而篩選基因編輯成功的個體。目前農業上主要采用農桿菌或基因槍侵染。這個過程中LGC Biosearch Technologies 可以提供專業高性價比的用于CRISPR sgRNA 文庫構建及質?？寺〉母惺軕B細胞，被多篇文獻報道過，其中也包括冷泉實驗室的CRISPR 慢病毒 gRNA libraries程序。在國內也有大量客戶在使用。
目前主要采用PCR技術來進行基因編輯個體及在第二代去掉外源載體或抗性基因（去標簽）后的基因型檢測。相對于測序來說，PCR成本更低，檢測周期更短，KASP基因分型技術因其低成本高通量的特點也越來越多用于基因編輯流程中的基因型檢測。
具體引物設計方法為：在基因編輯序列或外源載體序列上設計一對引物，正向引物5’端加入FAM接頭序列，然后在看家基因上設計另一對引物，其正向引物5’端加入HEX接頭序列。這樣我們通過KASP終點法PCR，就可以對基因編輯的個體進行定性分析，如果是非基因編輯的個體，則只有看家基因被擴增，所以只能檢測到HEX熒光（如下圖紅色的分群），而基因編輯成功的個體則同時帶有FAM和HEX兩種熒光（如下圖綠色的分群）。
* 本文轉載自LGC基因組學公眾號
